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Y2hgold酵母感受态细胞
Y2HGold酵母 感受态细胞

产品名称:Y2HGold酵母 感受态细胞

产品简介:

Y2HGold 感受态细胞购买酵母感受态赠YPD培养基一瓶。

Y2HGold Competent Cell

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 产品名称

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单位

北京华越洋2DP320

Y2HGold感受态细胞

-80°c, 六个月

1pcs, 100ul/

基因组MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS–Gal1TATA–His3, GAL2 UAS–Gal2TATA–Ade2 URA3 : : MEL1UAS–Mel1TATA  AUR1-C MEL1

Y2HGold 感受态细胞产品说明:

 

Y2HGold菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株,MATa型,可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation  marker: trp1, leu2,报告基因为:AbAr, HIS3, ADE2, MEL1

Y2HGold -GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:PGBKT7PGADT7。质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1,用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白;质粒PGADT7的筛选标志为LEU,用于表达AD(GAL4 C768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。GAL4系统原理:一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域:位于N1 ~ 174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C768 ~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS,并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BDAD单独存在不能激活转录,但当二者接近时,则呈现完整的GAL4活性,使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下,BD不与AD结合,将要检测的蛋白质分别与BDAD融合,形成bait 融合蛋白(bait -BD)和 prey 融合蛋白(prey-AD),如果 bait  prey发生相互作用,就会促使 BD  AD 的相互接近,形成完整的GAL4,从而激活报告基因的转录。

Y2HGold有四个报告基因:AbAr, HIS3, ADE2, MEL1,分别由三种不同的启动子(G1G2M1)启动,这三种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同,其余部分均不同,大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。此外新报告基因AbAr与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点,也可以降低酵母双杂假阳性发生的概率。Y2HGold 感受态细胞

Y2HGOLD酵母感受态细胞 操作方法:

 

1. 100 μl冰上融化的Y2HGold感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒1-5ugCarrier DNA95-1005min,快速冰浴,重复一次)10 ul PEG/liAC 500ul并吸打几次混匀,30度水浴30 分钟(15 min时翻转6-8次混匀)。 

2. 将管放42度水浴15min 7.5 min时翻转6-8次混匀)。 

3. 5000 rpm 离心 40s 弃上清,ddH2O 400ul 重悬,离心 30s 弃上清。 

4. ddH2O 50ul重悬,涂板,29培养48-96h

Y2h酵母感受态细胞注意事项:

1. 感受态细胞最好在冰上融化。转化高浓度的质粒可减少用于涂板的菌量,同时转化2-3种质粒时应增加质粒的用量。 

2. Y2HGold酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27-30;高于31,生长速度和转化效率呈指数下降。 

3. 菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine被消耗完,酵 母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破坏,Adenine合成途径受阻;又由于  ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P-ribosylamino imidazoleAIR)的积累而使菌落变为粉红色。

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