内毒素清除剂主要用于清除DNA、蛋白质或其他液体样品中的内毒素。在特定的pH值、盐浓度和温度条件下,内毒素清除剂能与DNA、重组蛋白以及液体样品中的内毒素特异性结合,经过室温高速离心后,DNA或蛋白质等保留在水相,而内毒素则被浓缩到极小体积的下层相而被清除。经过3次以上重复抽提后可将活性为5000~50000EU/ml的内毒素水平降低到5~0.5 EU/ml以下,即降低1000~10000倍。
内毒素清除剂操作步骤: 提取前请将内毒素清除剂放在冰上冰浴5min,期间翻转瓶子数次使试剂均匀预冷。
1、a)已纯化的质粒DNA内毒素清除:吸取500μlDNA溶液于微型离心管,加入1/10体积3M NaAc pH5.2 或1/20体积5M NaCl溶液,冰浴5min。b)在提取质粒DNA过程中清除内毒素:以碱裂解法提取质粒为例,在加入裂解液和中和液并离心去除碎片之后,吸取含质粒DNA的上清于新离心管中,冰浴5min。
2、加入1/5体积预冷的内毒素清除剂,振荡混匀,溶液变浑浊。
3、冰浴5min,溶液应变清亮。
4、37℃水浴5min,不时振荡,溶液又变浑浊。
5、12000rpm室温离心5min,溶液应分为两相,上层水相含DNA,下层油状相含内毒素。
6、将含DNA的上层水相转移到新管,弃油状相,重复抽提三次,即重复步骤2-6三次。
7、加入2.5体积无水乙醇,-20℃沉淀30min或过夜;12000rpm离心10min,弃上清;加入70%乙醇洗涤沉淀,12000rpm离心5min弃上清;空气干燥沉淀,加入100~200μl无内毒素的高纯水或TE溶解沉淀。
8、用内毒素检测试剂测定样品中内毒素活性,并与初始样品比较。
华越洋内毒素清除剂注意事项:
1、DNA浓度>1mg/ml时清除内毒素效率降低。由于DNA和蛋白质本身的性质,清除程序可导致10-20%的DNA丢失,所幸的是与清除内毒素的艰难相比DNA更容易提取制备。 2、所有溶液应用无内毒素的高纯水配制,所有器械材料均应不含内毒素,玻璃器皿可高温烘烤,非挥发性水溶液可高压120℃高温处理。
保存:4℃半年有效,-20℃长期储存。