一站式His标记蛋白质纯化试剂盒
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His标记蛋白纯化试剂盒
原理及特点基于His-Ni亲和层析的蛋白质纯化方法是目前分离纯化重组表达蛋白质的重要方法，本产品就是专门用于上述实验的一站式产品，具有下列特点：
1. 一站式套装，含所需的介质、溶液和层析柱，用户只需要提供表达His蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。
2. 专一性强，一次过柱即可获得纯度高达95%的His-标记蛋白。
3. 变性和非变性条件均可使用，也适用于纯化包涵体中的His标记蛋白。
4. 每次可以处理20 mL的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。
5. 提供2 mL Ni-Agarose介质，其最大载量为20-30 mg His标记蛋白质。
6. 介质为CL-6B琼脂糖，含四个Ni离子螯合基团，比只有四个Ni离子螯合基团的Ni-IDA更有效。
7 .本介质可以反复使用多次.
His标记蛋白纯化试剂盒
A型用于超声破细胞，B型用于酶溶破细胞。
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成份
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20次小盒包装A型
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20次小盒包装B型
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Ni-Agarose介质
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2 mL
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2 mL
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1M咪唑溶液
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25 mL
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25 mL
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1 M Tris-HCl pH7.9
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25 mL
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25 mL
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5 M NaCl溶液
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25 mL
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25 mL
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溶菌酶(20 KU/mg)
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无
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30 mg
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Benzonase（2U/uL）
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无
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20 uL
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盐酸胍
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15 g
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15 g
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尿素
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20 g
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20 g
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PMSF(10 mg/mL)
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0.5 mL
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0.5 mL
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层析柱
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1只
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1只
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使用手册
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1份
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1份
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运输及保存：常温运输和保存，但介质需4℃保存，溶菌酶、Benzonase和PMSF需-20℃保存，有效期一年
自备试剂：去离子水、20%乙醇、0.45 μm滤膜
使用方法：
1. 将Ni-Agarose介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质用量需要根据His蛋白产量决定，100 mL菌液一般使用200 uL介质即可。本产品提供的4 mL介质的浓度为50%，所以要取200 uL介质，则需要摇匀后取400 uL介质和保存液混合物）。下列步骤各溶液的用量均针对200 uL介质而定，对不同介质用量，各溶液用量均需调整。
2. 用1 mL自备去离子水洗柱，共三次。
3. 用1 mL新配结合液洗柱，共三次。结合液的配方如下（以10 mL为例）：
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成分
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用量
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在结合缓冲液中的浓度
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1M Tri-HCl（pH7.9）
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0.2 mL
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20 mM
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1M 咪唑溶液
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0.1 mL
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10 mM
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5M NaCl溶液
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1 mL
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500 mM
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自备去离子水
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8.7 mL
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-
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4. 室温5000 g离心10分钟收集20 mL表达菌液，弃上清，沉淀（约100 mg）放冰上待用或放-80℃保存。最好用不加诱导物的菌液做对照样。
5. 如果用本产品A型：加入1 mL冰浴的结合液（1 mL菌液需要用50 uL结合液），再加入25 uL PMSF9 (10 mg/mL)溶液，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。如果用本产品B型：加入1 mL冰浴的含溶菌酶的结合液（先取20 mL结合液，加入所有30 mg溶菌酶干粉，溶解后分装成1 mL/管，剩余的-20℃放置），再加入25 uL PMSF (10 mg/mL)溶液和1 uL Benzonase，冰上放置30分钟。
6. 4℃13000-15000 g离心10分钟去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清，留样做SDS-PAGE电泳对照。如果要纯化裂解液中可溶部分的His标记蛋白，则直接进入第7步；如果要纯化裂解液中包涵体（沉淀部分）中的His标记蛋白，则直接进入第12步。
His标记蛋白纯化试剂盒
A、纯化细胞裂解液中可溶部分的His标记蛋白
7. 将上步得到的上清液上柱，让重力使裂解液自然流出。如要提高His标记蛋白与介质的结合效率，可用试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在4℃结合30分钟或过夜。
8. 用2 mL结合液洗柱（配方见上表），收集并保存穿透液（含杂质或没被吸附的His标记蛋白，可做SDS-PAGE电泳的对照）。
9. 如果用一步式洗脱法（适合已经找到最佳咪唑浓度的情况），则直接用1 mL新鲜配制的洗脱液洗柱，收集并保存穿透液（含His标记蛋白）。洗脱液的配方如下（以1 mL体积和最佳咪唑浓度是500 mM为例）：
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成分
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用量
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在洗脱液中的浓度
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1M Tri-HCl （pH7.9）
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20 uL
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20 mM
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1M 咪唑溶液
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500 uL
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500 mM
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5M NaCl溶液
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100 uL
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500 mM
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自备去离子水
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380 uL
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-
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10. 如果用多步式洗脱（适合不知道最佳咪唑浓度或一步式洗脱杂质多的情况），则按上表配制一系列咪唑浓度不同（如40、60、100、200、300和500mM），其他成分浓度不变的洗液，按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE电泳检测His标记蛋白所在的区域。
11. 分别用500 uL结合液、1 mL自备去离子水和500 uL 自备20%乙醇洗柱一次，最后堵住层析柱下端的漏口，加500 uL 20%乙醇将介质淹没，4℃保存待下次使用。
B、纯化包涵体中His标记蛋白
12. 将第6步离心得到的包涵体沉淀重悬于1-3 mL含盐酸胍结合液中或1-3 mL含尿素结合液中（建议优先使用尿素做变性剂，因为得到的洗脱液可以直接跑SDS-PAGE，而用盐酸胍的洗脱液需先除盐后才能电泳）。冰浴1小时以使包涵体溶解，期间可轻柔摇晃几次。含变性剂的结合液配方如下（以1 mL为例）：
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成分
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含盐酸胍结合液
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含尿素结合液
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1M Tri-HCl （pH7.9）
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200 uL
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200 uL
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5M NaCl溶液
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1 mL
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1 mL
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盐酸胍（MW=95.6）
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5.7 g
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无
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尿素（MW=60.1）
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无
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4.8 g
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自备去离子水
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加水到10 mL
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加水到10 mL
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13. 室温10000×g离心20分钟，沉淀为未溶解的包涵体。将上清（含溶解后的His标记蛋白）以自备的0.45 μm滤膜过滤。
14. 将滤过液上柱，后续纯化步骤同第7-第11步。只是所用结合液和洗脱液均含变性剂，含变性剂的洗脱液配方见下表（以1 mL为例）：
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成分
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含盐酸胍洗脱液
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含尿素洗脱液
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1M Tri-HCl （pH7.9）
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20 uL
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20 uL
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1M 咪唑溶液
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500 uL
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500 uL
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5M NaCl溶液
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100 uL
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100 uL
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盐酸胍（MW=95.6）
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0.57 g
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无
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尿素（MW=60.1）
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无
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0.48 g
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自备去离子水
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补水到1 mL
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补水到1 mL
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注意事项：整个实验需避免含巯基乙醇、DTT和EDTA等成分。若洗脱液不能将His标记蛋白洗脱下来，可改用pH 6.5- 4.5的pH递减的Tris-HCl洗脱。
His标记蛋白纯化试剂盒关联生化试剂，耗材华越洋均有销售。