产品名称：western blot实验，westernblot

产品简介：

蛋白印迹，也称Western，Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作。
       1.蛋白样品的制备(Protein sample preparation)
可以选用适当的裂解液(华越洋生物：高效RIPA组织/细胞裂解液），裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行蛋白抽提（华越洋生物：组织/细胞总蛋白提取试剂盒（大，中，微量提取）。
   为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。华越洋生物：超灵敏蛋白定量试剂盒准确检测蛋白浓度（Bradford法蛋白定量试剂盒，BCA法蛋白定量试剂盒，超敏型BCA法蛋白定量试剂盒，改良Lowry法蛋白定量试剂盒福林酚试剂、蛋白质定量标准品）

       2. 电泳
       (1)SDS-PAGE凝胶配制
       SDS-PAGE凝胶可以参考文献资料进行配制，（华越洋生物：SDS-PAGE一站式电泳全套装）该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
       (2)样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，于100℃或沸水浴中加热3-5分钟，以充分变性蛋白。使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制（华越洋生物：SDS-PAGE一站式电泳全套装中已配好）。Tricine-sds-page电泳套装，蛋白非变性PAGE电泳套装。
       (3) 上样与电泳
       冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准（华越洋生物提供这种范围长度的蛋白marker ）。电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可设置在120V左右。标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可设置在120V左右。
       采用普通的电泳仪就可以满足SDS-PAGE电泳的要求。为方便起见，也可整个SDS-PAGE电泳过程均采用恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。
       通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。华越洋蛋白质胶回收试剂盒，PAGE胶染料
       3. 转膜(Transfer)华越洋生物WB转膜液
       在Western实验中，我们推荐选用华越洋生物的硝酸纤维素膜(NC膜)13*20cm,硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
       转膜时，具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。如使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，转膜电流可设定为80V/2H or 10V过夜。
       在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝染色液对转膜后的PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
        4. 封闭(Blocking) 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的华越洋生物WB洗膜液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕起，以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。可用巴斯特吸管吸尽洗涤液，加入WB封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。如背景较高，可以在4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中可使用侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
        5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
        参考华越洋生物一抗的说明书，按比例用WB一抗稀释液适当稀释一抗。用巴斯特吸管吸尽封闭液，不要漂洗，直接加入稀释好的一抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时在再37℃水箱一小时。如果效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后，再加入WB洗涤液，，漂洗3-6次，每次5-10分钟。如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。
        6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
        参考华越洋生物二抗的说明书，按照适当比例用WB二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用巴斯特吸管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3-5次，每次5-10分钟。如果显色结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
        7. 蛋白检测(Detection of proteins)
       检测结果可使用华越洋生物显色试剂（增强型DAB，沉淀型TMB显色试剂盒）来检测蛋白，具体使用细节请参考相关产品说明书.
       8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
       如果蛋白样品非常宝贵，可以使用华越洋生物WB抗体去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。

Western-Blot杂交科研服务     北京华越洋生物 www.huayueyang.com

（一）合同内容

1、收费标准

2、客户需要提供

1）目标蛋白一抗（特殊内参或公司没有的物种的内参客户也需提供一抗）；

2）保存完好的组织材料或模板；

3）其他我方认为实验必须的相关资料或材料。

3、公司承担责任

我方负责对客户提供的样品进行蛋白的提取、电泳，并提交给客户电子版检测报告，包括详细操作程序和实验结果等。我方对实验结果以及客户所提供的资料保密，未经客户许可，我方不得将客户的实验内容、实验结果和相关信息对外公布。

4、备注

1）用户委托本公司进行实验服务时，需预付实验总费用的50%作为定金，余款在实验结束后，本公司向用户交付实验结果后一次性付清；

2）实验所需试剂及耗材由本公司免费提供，用户无须另行购买；

3）由用户所提供的样品或材料所致的实验问题由用户负责；

4）提交报告时间日期以乙方收到预付款及合格样品后30个工作日内，以电子版交给甲方。重复实验不另外收取费用；

5）如样品质量不合格或需重复实验，甲方应继续提供。

Western Blotting的常见问题及解决方法（仅供参考）北京华越洋生物

北京华越洋生物有限公司

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