Q: 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
A:
1. 大肠杆菌老化：请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2. 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3. 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
4. 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或
增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。
5. 溶液使用不当：溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
6. 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分
多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非
常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。
7. 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8. 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。
9. 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅
胶膜的表面达到最大洗脱效率。
10. 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
11. 洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
12. 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1分钟可达到较好的效果。

Q: 质粒纯度不高，如何解决？
A:
1. 混有蛋白：不要使用过多菌体。经溶液P1、P2、P3处理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。
2. 混有RNA：RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNaseA。
3. 混有基因组DNA：加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。
4. P3溶液加入时间过长：P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。
5. 含大量核酸酶的宿主菌：宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和Top10。
6. 质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。