Real-time qPCR 常见问题分析

1. 做标准曲线时候，可否用2个不同体系浓度的稀释分别对于内参和目的基因？

建议最好用同样稀释倍数做曲线，因为模板浓度会影响扩增效率。

2. 熔解曲线中，Tm不出现在80度左右？

扩增片段100bp左右的，一般应该出现在80度左右。如果低于此温度出现，可能是模板降解。

3. 扩增曲线没有Ct值，仅仅一条斜线？什么原因？

模板浓度过低或者模板降解。

4. 如果内参和目标基因表达量差别比较大，也就是目的基因的表达量少，

Ctcon=15，Cttarget=38，可否应用？

可以用于数据分析。因为表达量低，从而用过高模板进行扩增，从而同内标的模板不同，反而会增大数据统计的误差。

5. 引物浓度可否是50nM，是否太低？

如果扩增曲线和熔解曲线比较好，这个浓度当然可以。如果更低，扩增结果好的情况下，同样可以运用。

一句话，所有的模板、引物等浓度尽量不要用高的，会影响扩增效率。

6. miRNA多个扩增时候，如果一个的扩增效果比较，其它熔解曲线不止一个峰，如何解决？

Primer对于miRNA是专一的。所以重新设计引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更换mastermix等。反应体系会影响反应产物的。

7. 相对定量方法，如果用Ct值比较，是各个样品平均后在2delt Ct还是分别2 delt Ct在平均比较好？

相对定量的方法各有优缺点，主要取决于实验的目的和材料的准备。如果是材料群体个体差异不大，这2种方法基本没有很大的区别；如果是个体差异比较大，建议用双标准曲线做。就是分别做内参和目的基因的标准曲线，分别带入Ct值计算。

8. 熔解程序可否不加？

如果是扩增效果好，特异扩增，可以不加熔解程序；但建议做好加上。

9. 扩增反应体系5uL，扩增效率低，什么原因？

反应体系小，各种因素的影响比较大，比如引物浓度、模板浓度及其金属离子等会影响扩增效率的。

10. 如何减少非特异性扩增的干扰？

设计一对好引物，提高primer的退火温度，以及设定吸光温度。

其他注意事项：   按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。 2.        应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C：/Appliedbiosystems/SDS Document。 3.        良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面： 电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。 通风：仪器的通风应该没有阻挡。 温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。 湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。 空间：易于操作，安全。 4. 怎样判断定量PCR仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染     一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。     清除样本加热块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。 吹打数次。 将废液吸入废液杯中。重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。确认反应孔中的残留液体蒸发完。