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技术资料
westernblot常见问题及分析
2011-6-20

Western Blot过程中常见的问题及可能原因分析

蛋白印迹,也称WesternWestern blotWestern blottingWestern印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作。

 蛋白印迹,也称WesternWestern blotWestern blottingWestern印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作。
       1.蛋白样品的提取制备(Protein sample preparation)
可以选用适当的裂解液(华越洋生物:高效RIPA组织/细胞裂解液),裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行蛋白抽提(华越洋生物:组织/细胞总蛋白提取试剂盒(大,中,微量提取)。
   为确保每个蛋白样品的上样量一致,收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法,应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用,因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。华越洋生物:超灵敏蛋白定量试剂盒准确检测蛋白浓度(Bradford法蛋白定量试剂盒,BCA法蛋白定量试剂盒,超敏型BCA法蛋白定量试剂盒,改良Lowry法蛋白定量试剂盒福林酚试剂、蛋白质定量标准品)
 

       2. 电泳
       (1)SDS-PAGE凝胶配制
       SDS-PAGE凝胶可以参考文献资料进行配制,(华越洋生物:SDS-PAGE一站式电泳全套装)该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
       (2)样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,于100℃或沸水浴中加热3-5分钟,以充分变性蛋白。使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制(华越洋生物:SDS-PAGE一站式电泳全套装中已配好)。Tricine-sds-page电泳套装,蛋白非变性PAGE电泳套装。
       (3) 上样与电泳
       冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准(华越洋生物提供这种范围长度的蛋白marker )。电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可设置在120V左右。标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可设置在120V左右。
       采用普通的电泳仪就可以满足SDS-PAGE电泳的要求。为方便起见,也可整个SDS-PAGE电泳过程均采用恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定时间为90120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。
       通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。华越洋蛋白质胶回收试剂盒,PAGE胶染料
       3. 转膜(Transfer)华越洋生物WB转膜液
       在Western实验中,我们推荐选用华越洋生物的硝酸纤维素膜(NC)13*20cm,硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
       转膜时,具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。如使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置,转膜电流可设定为80V/2H or 10V过夜。
       在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝染色液对转膜后的PAGE胶进行染色,以观察蛋白的残留情况。
        4. 封闭(Blocking) 转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的华越洋生物WB洗膜液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕起,以后所有的步骤均要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。可用巴斯特吸管吸尽洗涤液,加入WB封闭液,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。如背景较高,可以在4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中可使用侧摆摇床,侧向摆动速度比较缓慢,而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
        5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
        参考华越洋生物一抗的说明书,按比例用WB一抗稀释液适当稀释一抗。用巴斯特吸管吸尽封闭液,不要漂洗,直接加入稀释好的一抗,室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时在再37℃水箱一小时。如果效果不佳,可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗,加入WB洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后,再加入WB洗涤液,,漂洗3-6次,每次5-10分钟。如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。
        6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
        参考华越洋生物二抗的说明书,按照适当比例用WB二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用巴斯特吸管吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗,加入WB洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后,再加入洗涤液,漂洗3-5次,每次5-10分钟。如果显色结果背景较高,可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
        7. 蛋白检测(Detection of proteins)
       检测结果可使用华越洋生物显色试剂(增强型DAB,沉淀型TMB显色试剂盒)来检测蛋白,具体使用细节请参考相关产品说明书.
       8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
       如果蛋白样品非常宝贵,可以使用华越洋生物WB抗体去除液处理蛋白膜,以重复利用蛋白膜。

Western-Blot杂交科研服务            北京华越洋生物 www.huayueyang.com

(一)合同内容

1、收费标准

起始材料

服务内容

规格

价格()

细胞或组织或提取好的蛋白

相对定量

内参基因

..

目的基因(每张膜1~8个样品)

..

2、客户需要提供

1)目标基因一抗(特殊内参或公司没有的物种的内参客户也需提供一抗);

2)保存完好的组织材料或模板;

3)其他我方认为实验必须的相关资料或材料。

3、公司承担责任

我方负责对客户提供的样品进行蛋白的提取、电泳,并提交给客户电子版检测报告,包括详细操作程序和实验结果等。我方对实验结果以及客户所提供的资料保密,未经客户许可,我方不得将客户的实验内容、实验结果和相关信息对外公布。

4、备注

1)用户委托本公司进行实验服务时,需预付实验总费用的50%作为定金,余款在实验结束后,本公司向用户交付实验结果后一次性付清;

2)实验所需试剂及耗材由本公司免费提供,用户无须另行购买;

3)由用户所提供的样品或材料所致的实验问题由用户负责;

4)提交报告时间日期以乙方收到预付款及合格样品后30个工作日内,以电子版交给甲方。重复实验不另外收取费用;

5)如样品质量不合格或需重复实验,甲方应继续提供。

Western Blotting的常见问题及解决方法(仅供参考)北京华越洋生物

北京华越洋生物有限公司

010-59564618 7*24H:15011481284         WWW.HUAYUEYANG.COM          QQ:1365647552

问题

可能原因

验证或解决办法

背景高

膜没有完全均匀湿透

使用100% 甲醇浸透膜5-10min

洗膜不充分

增加洗液体积和洗涤次数

阻断不充分

增加封闭液孵育时间,或者提高温度。选择合适的封闭试剂(脱脂奶粉,BSA,酪蛋白等)

二抗浓度过高

降低二抗浓度

检测过程中膜干燥

保证充分的反应液,避免出现干膜现象

曝光过度

缩短曝光时间

抗体与阻断蛋白有交叉反应

检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性,选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应

没有阳性条带,或者阳性条带比较弱

抗体染色不充分

增加抗体浓度,延长孵育时间

酶失活

直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物

标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。

试剂不匹配

一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性

一抗失效

选择在有效期内抗体;并选择现配现用的工作液

HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

膜没有完全均匀湿透

使用100%甲醇浸透膜

靶蛋白分子量小于10Kd

选择小孔径的膜,缩短转移时间

甲醇浓度过高

过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离,从而沉淀在凝胶中,同时会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替

转移时间不够

对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间

抗体染色不充分

增加抗体浓度,延长孵育时间

标本中靶蛋白含量太低

增加标本上样量。

HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

抗体活性降低

选择在有效期内的抗体,工作液现配现用,避免长时间放置

封闭过度

减少封闭剂的量或缩短时间;换用不同封闭剂类型

曝光时间过短

延长曝光时间

条带位置不对;或有非特异性条带

色带)

二抗的非特异性结合

增加一个对照:不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗(特异性更强的,只针对重链的)

一抗的特异性不够

使用单克隆或者亲和纯化的抗体,保证抗体的特异性

蛋白降解

使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂

二聚体或多聚体存在

增加蛋白质变性过程及强度

抗体浓度过高

降低抗体(一抗、二抗)浓度,可以减少非特异性条带

蛋白上样量过大

降低上样量

封闭剂中有聚集体

使用前过滤封闭试剂

HRP耦联二抗中有聚集体

过滤二抗试剂,去除聚集体

HRP含量过高

降低酶联二抗的浓度


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