产品名称：蛋白样品提取到显色检测系列产品二

产品简介：

蛋白印迹，也称Western，Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作。
       1.蛋白样品的提取制备(Protein sample preparation)
    可以选用适当的裂解液(华越洋生物：高效RIPA组织/细胞裂解液），裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行蛋白抽提（华越洋生物：组织/细胞总蛋白提取试剂盒（大，中，微量提取）。
    为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。华越洋生物：超灵敏蛋白定量试剂盒准确检测蛋白浓度（Bradford法蛋白定量试剂盒，BCA法蛋白定量试剂盒，超敏型BCA法蛋白定量试剂盒，改良Lowry法蛋白定量试剂盒福林酚试剂、蛋白质定量标准品） 

       2. 电泳 (1)SDS-PAGE凝胶配制
       SDS-PAGE凝胶可以参考文献资料进行配制（华越洋生物：SDS-PAGE一站式电泳全套装）该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂及配制各种浓度SDS-PAGE的配方
       (2)样品处理
    在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，于100℃或沸水浴中加热3-5分钟，以充分变性蛋白。使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制（华越洋生物：SDS-PAGE一站式电泳全套装中已配好）。Tricine-sds-page电泳套装，蛋白非变性PAGE电泳套装。
       (3) 上样与电泳  冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准（华越洋生物提供这种范围长度的蛋白marker ）。电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可设置在120V左右。标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可设置在120V左右。
       采用普通的电泳仪就可以满足SDS-PAGE电泳的要求。为方便起见，也可整个SDS-PAGE电泳过程均采用恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。华越洋蛋白质胶回收试剂盒，PAGE胶染料
       3. 转膜(Transfer)华越洋生物WB转膜液
       在Western实验中，我们推荐选用华越洋生物的硝酸纤维素膜(NC膜)13*20cm,硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
       转膜时，具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。如使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，转膜电流可设定为80V/2H or 10V过夜。
       在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝染色液对转膜后的PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
        4. 封闭(Blocking) 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的华越洋生物WB洗膜液中漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕起，以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。可用巴斯特吸管吸尽洗涤液，加入WB封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟如背景较高，可以在4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中可使用侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
        5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
        参考华越洋生物一抗的说明书，按比例用WB一抗稀释液适当稀释一抗。用巴斯特吸管吸尽封闭液，不要漂洗，直接加入稀释好的一抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时在再37℃水箱一小时。如果效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后，再加入WB洗涤液，，漂洗3-6次，每次5-10分钟。如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。
        6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
        参考华越洋生物二抗的说明书，按照适当比例用WB二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用巴斯特吸管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3-5次，每次5-10分钟。如果显色结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
        7. 蛋白检测(Detection of proteins)检测结果可使用华越洋生物显色试剂（增强型DAB，沉淀型TMB显色试剂盒）来检测蛋白，具体使用细节请参考相关产品说明书.
       8. 膜的重复利用(Membrane recovery)如果蛋白样品非常宝贵，可以使用华越洋生物WB抗体去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。

                   快速型Western blot检测试剂盒

实验流程非常快捷。无需二抗。可重复性好灵敏度高。适用于HRP/AP系统发光或显色检测

试剂盒组成                      规格（10次，50次）  WB1210     WB1250

封闭液                          100ml    500ml             

抗体反应液HRP/AP（兔，鼠）     1ml      5ml

抗体稀释液                      100ml    500ml

漂洗液                          100ml    500ml

本公司试剂盒极具实验流程优化效果，比常规间接法检测过程（封闭，一抗结合和二抗结合）时间短，在不弱化灵敏度的前提下可节约1小时左右。蛋白转移到膜上后，封闭液做短时间孵育，再用抗体反应液处理后的一抗孵育印迹膜，经三次洗涤（每次5分钟）即可进行发光或显色检测。NC膜，PVDF膜，X线暗盒，X光胶片，定影粉，显影粉等耗材华越洋均有提供。

Western-Blot杂交科研服务            北京华越洋生物 www.huayueyang.com

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