产品名称：荧光定量PCRmix AB型
产品简介：
实时荧光定量PCRmix AB型
CATNO: AB3126plus-200R（5ml） 包 装 量：1.25mlX4支
产品组成、储存、浓度：
储存：－20 ℃ 避光保存至少6个月，使用前充分融解混匀。短期使用可放在4 ℃，避免反复冻融。
制品说明：本制品本制品是采用SYBR® Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。已经将热启动HotMaster Taq DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA和SYBR® Green I等试剂预混成一种适合Real Time PCR反应检测用2×Premix Type试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板和引物和水，便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。本品采用全新的Hotmaster Taq DNA 聚合酶，该酶不同于一般Hot-start 酶之处在于，一般的Hot-start 酶只在第一步温度升高之前封闭酶的活性，而Hotmaster Taq DNA 聚合酶是利用抑制剂通过温度调节方式封闭Hotmaster Taq DNA聚合酶的底物结合位点，温度低于40℃时，形成非活性的酶-抑制剂复合物，当温度升高至引物特异性的退火温度时，结合平衡向模板-特异性引物复合物形成方向移动，因此最大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。
注意事项：
1. 本制品不含参比染料ROX，客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX参比染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，配套ROX产品货号为华越洋GT231Rox Reference Dye。
2. 本制品含SYBR® Green I 强光下易分解，降低敏感度，使用时避免长时间强光照射本制品。
3. 建议在冰上配制PCR反应液，再放入PCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。
4. 本制品含有4 mM MgCl2（反应体系终浓度是2 mM Mg2+），可用25mM MgCl2 优化Mg2+浓度。
建议PCR条件(以25，50 μl反应体系为例，反应液配制请在冰上进行)
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Components
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Volume（25 μl）
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Volume（50 μl）
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Final Concentration
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2 x SYBR qPCR Mix
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12.5μl
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25 μl
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1×
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DNA Template
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1 μl
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2 μl
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as required
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Forward Primer (10 μM)
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0.5 μl
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1 μl
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0.2 μM each
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Reverse Primer (10 μM)
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0.5 μl
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1 μl
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0.2 μM each
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ddH2O to final volume
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25 μl
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50 μl
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Not applicable
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PCR 循环（二步法）2-3步40个循环
1 94℃ 2-3 min
2 94℃ 5-10 sec
3 60℃ 30-34 sec
Dissociation Stage
PCR 循环（三步法） 2,3,4步40个循环
1 94℃ 2-3 min
 2 94℃10-20 sec3 55-60℃ 10-20 sec
4 72℃ 20-30 sec
Dissociation Stage
说明：本制品兼容性强，适用于不同厂家、型号的荧光定量PCR仪，绝大多数情况下使用二步法和三步法均可获得良好效果。在实际使用中可以根据机型推荐和具体情况对程序加以微调。一般来说，二步法扩增特异性高，三步法扩增效率高。如果融链曲线较差，可以尝试两步法扩增；若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。
荧光定量PCR实验常见问题和解决方案
A1: 无信号值出现
Q1：
1. 反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2. 检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3. 引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。
4. 引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5. 模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6. 模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
A2: CT值出现过晚
Q2：
1. 扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2. PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3. PCR产物太长。一般采用100-150bp的产物长度，一般不超过500bp。
A3: 标准曲线的线性关系不佳
Q3：
1. 加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2. 标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3. 引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。
4. 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
典型扩增曲线和融链曲线图（使用本制品在Roche Light Cycler 480 II 三步法操作实际图片）
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