产品名称：反转录试剂盒CB型
产品简介：
反转录试剂盒（第一链合成试剂盒）
Script cDNA Synthesis Kit(WX2050)
产品简介：
本产品是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒中使用的Script逆转录酶是M-MLV由来的新型高效逆转录酶，新颖突变位点大幅提升酶的转录活性，cDNA第一链合成的效率和产量更高，可利用pg级的总RNA或mRNA合成cDNA第一链。点突变消除RNase H活性，酶的延伸性能提高，有效改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12 kb的cDNA。精心优化的RT Buffer使逆转录酶应用范围更广，对后续的PCR以及定量PCR实验兼容性高。该试剂盒配备所有逆转录试剂，使用简单方便。适用于第一链cDNA的合成和后续的RT-PCR、RT-qPCR，以及全长cDNA文库的构建等。本试剂盒有以下特点：
1．高效的逆转录效率：新颖突变位点大幅提升酶活性能，获得更高产量的cDNA。
2．良好的延伸能力：点突变消除RNase H活性，改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12 kb的cDNA。
3．灵敏度高：可利用pg级的总RNA或mRNA模板合成cDNA第一链。
4．使用方便：逆转录试剂盒中已配备所有逆转录试剂，仅需准备模板即可轻松完成逆转录。
产品构成：
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Component
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100 rxns
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Script，200 U/μl
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100 μl
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5×RT Buffer
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500 μl
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Primer Mix
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240 μl
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dNTP Mix，2.5 mM Each
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500 μl
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DTT，0.1 M
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240 μl
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RNase-Free Water
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1 ml
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保存条件：-20℃
注意事项：
1．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，应注意以下几方面：
1）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2）配制溶液应使用无RNase的水。
3）操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
2．实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。
3．本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
4．若起始RNA的量小于50 ng，建议加入RNA酶抑制剂。
操作步骤：注意：1 ng-5 μg总RNA可建立20 μl反应体系，如果总RNA量大于5 μg，请按比例扩大反应体系。
I. 逆转录操作步骤：
1．将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、Script和RNase-Free
Water溶解并置于冰上备用。
2．根据以下表格配制反应体系，总体积为20 μl。
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试剂
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20 μl反应体系
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终浓度
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dNTP Mix，2.5 mM Each
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4 μl
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500 μM Each
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Primer Mix
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2 μl
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RNA Template
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X μl
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50 pg-5μg
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5×RT Buffer
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4 μl
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1×
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DTT，0.1 M
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2 μl
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10 mM
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Script 200 U/μl
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1 μl
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RNase-Free Water
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up to 20 μl
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注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂。
2）Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。
3．涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4．cDNA合成反应条件：
1）若下游进行荧光定量PCR检测，42℃孵育15分钟，85℃孵育5分钟。
2）若下游进行普通PCR检测，42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。
注意：对于二级结构复杂或GC含量高的模板，可以提高逆转录温度至50℃，增强逆转录效率。
5．反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
6． 逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。 |